微生物限度检查法 -结果判定

　　被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值大于70%，且菌落形态大小

应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。计数方法的验证当建立产

品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法

适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响

检验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规

定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。菌种及菌液制备 同计数培养

基的适用性检查验证方法 验证试验至少应进行3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次

试验的回收率。

　　（1）试验组 平皿法计数时，取试验可能用的zui低稀释级供试液1ml 和50～100cfu 试验

菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌

数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的zui低稀释级供试液，过滤，冲洗，在zui后一次

的冲洗液中加入50～100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。
 

　　（2）菌液组 测定所加的试验菌数。

　　（3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

　　（4）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理

时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应

的稀释液替代供试品，加入试验菌，使zui终菌浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的

供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。结果判断 在3 次独立的平行试验中，稀释剂对照

组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。

若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平

均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵

母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜

过滤法、中和法（表1）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验

证。表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法干扰物 可选用的中和剂或灭活方法戊二醛 亚硫酸氢

纳酚类、乙醇、吸附物 稀释法醛类 稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐季铵类化合物（QACs）、对

羟基苯甲酸酯、 卵磷脂、聚山梨酯汞类制剂 亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐双胍类化

合物 卵磷脂酒、洗必泰类 聚山梨酯卤化物 硫代硫酸盐 乙二胺四乙酸（EDTA） 镁或钙离子磺

胺类 对氨基苯甲酸。
 

　　若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是

因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。但是，供试品也可能仅对

试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限

度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释

级的供试液进行方法验证试验。若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为zui低稀释级的

供试液进行供试品检验。计数方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率

达不到要求，那么选择回收情况zui接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。验证试验也

可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

供试品检查

　　计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉

菌及酵母菌菌数的测定。控制菌检查方法的验证当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控

制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。若药品的组分或原检

验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。验证时，依各品种项下微生物限

度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌

作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。菌种及菌液

制备 同控制菌检查用培养基的适用性检查 。

验证方法

　　取规定量供试液及10～100cfu 试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。

当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在zui后一次冲洗液中，过滤

后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。结果判断 若上述试验检出试验菌，按此供

试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养

基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑

菌活性，并重新进行方法验证。验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。供试品检查供

试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。

阳性对照试验 供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10～

100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。阴性对照试验 取稀

释液10ml 照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。