免疫共沉淀技术服务

1、 免疫共沉淀服务流程

① 收集培养的细胞(1×107～1×108);

② 用细胞裂解液裂解细胞

③ 冷冻离心机离心，取上清;

④ 加入相应抗体，温育过夜;

⑤ 预处理protein A琼脂糖珠;

⑥ 将预处理过的protein A琼脂糖珠加入到上述液体，温育;

⑦ 低速离心，将琼脂糖珠离心至管底;

⑧ SDS-PAGE、Western印迹或质谱仪分析。

注：以上流程是以Protein A琼脂糖珠法为例，根据免疫共沉淀方法不同，操作步骤有所区别。

图1 免疫共沉淀流程

2、 免疫共沉淀原理

免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP)是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。Co-IP是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。免疫共沉淀技术基本原理是细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western印迹分析。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质问的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定某一特定蛋白质新的作用辅助方法(图2)。

图2免疫共沉淀原理

3、 免疫荧光分类

① Protein A琼脂糖珠法;

② Protein G-Sepharose法;

③ 已知抗体蛋白耦联磁珠法;

4、 免疫共沉淀优缺点：

① 免疫共沉淀优点：

a: 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响;

b: 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物;

c: 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态;

② 免疫共沉淀缺点：

a: 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用;

b: 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质—蛋白质相互作用;

c: 实验具有不确定性：实验前预测目的蛋白以选择检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。

5、 免疫共沉淀所需材料

(以Protein A琼脂糖珠法为例)

① 免疫共沉淀试剂：

a: SDS-PAGE制胶缓冲液;

b: SDS-PAGE电泳缓冲液;

c: Loading Buffer;

d:考马斯亮蓝或硝酸银;

e:考马斯亮蓝脱色液或银染脱色液;

f: PBS缓冲液;

② 免疫共沉淀耗材：

a: 待检样本(培养细胞);

b:细胞裂解液;

c: Protein A琼脂糖珠;

d:丙烯酰胺;

e: N,N,-甲叉双丙烯酰胺;

③ 仪器：

a: 质谱分析仪;

b: 蛋白质电泳槽装置;

c: 蛋白质电泳仪;

d: 台式冷冻离心机;

图3蛋白质电泳槽图 图4台式冷冻离心机

6、 材料要求

① 避免细胞污染;

② 收集细胞时，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用;

③ 实验材料涉及危险品，loogene公司不予服务;

④ 待检细胞尽量新鲜，待测细胞生长状态良好;

⑤ 提供尽量详细的实验背景材料;

⑥ 使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。

7、 实验周期

① 1-10个样本，10个工作日

② 10-100个样本，20个工作日

③ 100个样本以上，40个工作日

8、 提供结果

完整的实验操作步骤、SDS-PAGE、Western印迹(图5)或质谱分析结果。

图5 Western印迹