细胞培养技术服务

1、 细胞培养服务流程

① 从动物组织切割、分离所需培养的组织(原代培养);

② 用灭菌PBS多次清洗组织，充分剪碎组织，用灭菌PBS清洗组织;

③ 静置数分钟，使组织沉淀于管底，弃上清;

④ 胰蛋白酶充分消化组织，弃上清;

⑤ 加入含小牛血清或胎牛血清的培养基，置于CO2培养箱培养;

⑥ 从CO2培养箱取出生长状态良好的单层原代培养细胞或传代培养细胞，于超净工作台中弃去培养液，用灭菌PBS清洗;

⑦ 加入适量胰蛋白酶消化液，静置片刻;

⑧ 倒置显微镜下观察细胞消化状态，如变圆，立即弃去消化液，加入培养液终止消化;

⑨ 终止培养，去除培养上清液;

⑩ 反复吹打培养液，制成单细胞悬液，分置于多个细胞培养瓶/皿，进行传代培养;

注：①～⑤为原代细胞培养主要步骤，⑥～⑩为传代细胞培养主要步骤。

图1细胞培养流程

2、 细胞培养的原理

细胞培养(cell culture)或组织培养是指把从活体取出的组织细胞，在人工建立的无菌、适当温度和营养的条件下，模拟其在体内的生长环境使其增殖或分化，并维持结构和功能的一种技术。该技术可从细胞或亚细胞水平帮助人类揭示其生、老、病、死的有关规律，探索优生、抗衰老、防治疾病的手段或途径，人为地诱导细胞遗传性状的改变，使其向更有利于人类和自然界的方向发展。其中狭义的细胞培养是指：单个细胞或细胞群在体外用人工建立的无菌、合适的温度和营养以及酸碱度适当的条件下，使其生存生长的一种操作技术。而组织培养( tissue culture)是指在营养及温度等适当的条件下维持组织在体外生长的一种操作方法。在习惯上也泛指所有的体外培养，即器官培养、组织培养和细胞培养的总称。组织培养是20世纪初[Harrison, 1907; Carrel, 1912]才创建的一种研究动物细胞行为的方法，那时只是为了避开因正常的体内自体调节以及实验应激所可能产生的机体整体因素的影响。原代细胞培养也称初代细胞培养，是从供体直接取材获取细胞后在体外进行的培养。这是建立各种细胞系( cell line)的*步和基础，。在此期间，细胞的生物学性状尚未发生很大变化，仍具有二倍体遗传特性，在一定程度上能反映体内状态。此期细胞呈活跃状态，可见细胞分裂但不旺盛。原代细胞培养多由各种细胞成分组成，比较复杂，即使是经过处理后的细胞，也仍具有异质性,主要表现在细胞形态和大小不一。传代细胞培养是指原代培养细胞一般经过1～4周的培养后，将细胞从一个培养瓶转移养瓶的分离过程。在传代期，细胞一般增殖旺盛，并能维持二倍体核型，大多数二倍体细胞在培养中维持有限生存期，体外zui多生存1年左右，传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期。为保持二倍体细胞的特性，细胞应在初代培养期或传代培养早期将部分细胞低温保存，以防污染等的丢失并备用。

3、 细胞培养优点

① 理化环境的调控：pH、温度、渗透压、O2和CO2的气压，它们受到非常的调节;

② 生理条件可以保持相对恒定：生理条件虽然不能总是被地界定，但可以保持相对恒定，大多数细胞系的培养仍然需要在培养基中添加血清或其他尚未被确认的成分;

③ 样品的特征和均一性：组织样品的异质性( heterogeneous)不可避免，但经过一次或两次传代以后，培养的细胞系会呈现为均一性的(或至少具有相同性质的)构成。这是因为每次传代时细胞随机混合，培养条件的选择性压力利于zui有活力的细胞生长，进而产生性质较均一的培养物;

④ 经济、规模和机械化;细胞培养些对种种物质的筛选和重复性试验都较便宜，并且还避免了动物实验所存在的法律、道德和伦理问题，多孔培养板和自动化技术方面的新进展也使组织培养在时间和规模上都更加经济有效;

⑤ 体内环境的体外模拟：灌注培养技术使特殊实验成分的释放在浓度、作用时间及代谢状态方面到控制。

4、 细胞培养缺点：

① 需要具备专业技能：培养技术必须在严格的无菌条件下进行，因为动物细胞的生物，如细菌、真菌、酵母的生长都要慢得多，这就需要操作者具备一定的技术与知识水平;

② 产量有限：细胞培养的一个主要局限性在于所付出的努力和物质只能生产出相当少的一些组织，对于绝大多数小实验室(只有两个或三个人从事组织培养)，每批的实际zui大产量可能只有l～10g细胞，100g以上的产量则意味着达到了企业化的小规模生产水平，这就意味着大多数实验室难达到规模化生产;

③ 去分化和选择：许多科学家发现经过几代的培养，细胞系容易丧失了其来源组织细胞的*表型特征，即去分化;

④ 细胞的起源：不论是什么原因，如果细胞丧失了分化的特性，就很难将培养的细胞与其来源组织中有功能的细胞起来;

⑤ 不稳定性：不稳定性是许多连续性细胞系(continuous cell line)所面临的主要问题，这是由于它们非整倍的染色体组成不稳定所导致的。

5、 培养细胞的生长特性

① 贴壁型细胞：大多数的活体体内细胞在体外培养时都需贴附在支持物上生长，这种生长方式称为贴附依赖性细胞，也称锚着依存性细胞，一般可分成以下3类：

a:上皮细胞型;

b:成纤维细胞型;

c:游走细胞型;

② 悬浮型细胞:在体外培养时，少数类型的细胞呈悬浮状态生长，在瓶皿内不贴壁，其生存空间大，能繁殖大量细胞，容易进行传代培养，但在观察细胞病变时不如贴壁细胞,如血液中的淋巴细胞、白细胞、脾、骨髓细胞以及某些肿瘤细胞等均属于此型细胞，观察时的形态多呈圆形;

6、 培养细胞所需材料

① 培养细胞试剂：

a:培养液，如MEM、DMEM、IMDM、RPMI1640等;

b:胎牛血清或小牛血清;

e:PBS缓冲液;

f:胰蛋白酶消化液;

② 培养细胞耗材：

a:组织或传代培养细胞;

b:细胞培养瓶/皿、离心管、细胞培养板;

c:无菌的tip头、吸管、滴管、吹打管;

d:刀、剪、镊等解剖用具(用于原代培养);

e:乙醇(用于原代培养);

f:细胞计数器;

g:细胞冻存管;

③ 仪器设备：

a: CO2培养箱(图2);

b:恒温水浴箱(图3);

c:高压蒸气灭菌器;

d:玻璃滤器和微量超滤膜滤器;

e:离心机;

f:液氮罐;

g:无菌操作室和超净工作台(图4);

h:普通显微镜、倒置显微镜等;

图2 CO2培养箱 图3恒温水浴箱 图4超净工作台

7、 材料要求

① 组织取材、切割等过程中充分清洗;

② 干净组织量新鲜;

③ 避免组织\细胞污染;

④ 实验材料涉及危险品，loogene公司不予服务;

⑤ 提供尽量详细的实验背景材料。

8、 实验周期

① 1-10个样本，20个工作日

② 10-100个样本，30个工作日

③ 100个样本以上，60个工作日

注：根据原代细胞培养或传代细胞培养以及细胞本身特性不同，实验时间有较大差异。

9、 提供结果

完整的实验操作步骤、对数生长期细胞或冻存状态的细胞、原代培养细胞、显微镜下细胞生长状态图(图5)等结果。

图5 细胞生长状态