实验目的：

掌握细胞计数的方法。

了解区分细胞存活状态的方法。

实验用品：

0.4%台盼蓝溶液、无水乙醇或95%乙醇溶液、脱脂棉

普通显微镜、试管、吸管、毛细吸管、细胞计数板、绸布。

实验原理：

在细胞培养工作中，常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度，如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别，冻存细胞复苏后的活力检测等。细胞悬液制备后，常用活体染料台盼蓝对细胞进行染色，进行细胞计数。台盼蓝不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色。而死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞内而使细胞着色（蓝色）。细胞计数一般用血细胞计数板，按白细胞计数方法进行计数，便于确定细胞的生活状况。

实验内容与方法：

（一）制备动物细胞悬液

将动物细胞用生物盐水制备成适当浓度的细胞悬液备用。

（二）细胞计数

1. 计数板处理

用无水乙醇或95%乙醇溶液擦拭计数板后，用绸布擦净，另擦净盖玻片一张，把盖片覆在计数板上面。

2. 染色

用滴管吸取0.4%台盼蓝染液，按1∶1比例加入细胞悬液中。从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖片之间的空隙中。注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡，否则要重做。稍候片刻，将计数板放在低倍镜下（10×10倍）观察计数。

3. 计数方法

按图计算计数板的四角大方格（每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方格中，如果有细胞位于线上，一般计下线细胞不计上线细胞，计左线细胞不计右线细胞。二次重复计数误差不应超过±5%（图7-1）。镜下观察，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞。

4. 计数的换算

计完数后，需换算出每ml悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为0.01 cm²，高为0.01 cm，这样它的体积为0.0001 cm³，即0.1 mm³。由于1 ml＝1000 mm³，所以每一大方格内细胞数×10 000＝细胞数/ml，故可按下式计算：

细胞悬液细胞数/ml＝4个大格细胞总数/4×10 000 

如计数前已稀释，可再乘稀释倍数。

计数细胞后，计算细胞悬液浓度并求出存活与死亡细胞数的比例。 

注意事项：

向计数板中滴细胞悬液时要干净利落，加量要适当，过多易使盖片漂移，或淹过盖片则失败，需重做，过少易出现气泡；不理想时，应重做；

镜下计数时，若方格中细胞分布明显不均，说明细胞悬液混合不均匀，需重新将细胞悬液进行混合，再重新计数。