乐享干货 | 抗体蛋白电荷变异体的形成机制与分析检测策略
时间：2023-10-12 阅读：4135
重组单克隆抗体是一种复杂的生物大分子，其不均一性导致抗体药物并不是单一的物质而是多种相关物质的混合物。由于重组单克隆抗体在生产、储存、运输等过程中往往会发生聚集、翻译后修饰、降解等变化，从而引起蛋白表面电荷的改变，这就是重组单克隆抗体电荷变异体形成的原因。
有研究表明，抗体电荷的变化可以改变抗体与蛋白/细胞膜的结合，从而影响抗体的组织穿透、分布和药代动力学(PK)。电荷变异体对于蛋白质的功能影响与其翻译后修饰的性质、修饰的位置和程度都有关键影响，充分解析其形成的分子基础与影响因素有助于在抗体药物开发中对其电荷异质性进行控制和调整。因此，对抗体药物相关物质变体的分析检测显得尤为重要。
本文将对单克隆抗体修饰对电荷变异体的产生以及分析方法进行小结。
01
抗体蛋白电荷变异体形成的原因
| N末端焦谷氨酸的形成
抗体分子轻链和重链的N末端往往是谷氨酸(Glutamate，Glu)或谷氨酰胺(Glutamine，Gln)。Glu和Gln在谷氨酰胺酰环化酶(Glutaminyl cyclase)的催化作用下可发生脱水或者脱氨反应，环化形成焦谷氨酸(pyro Glu)。
重组单克隆抗体N末端含有Gln一般会环化形成pyro Glu，而N末端含有Glu通常会以天然的形式存在。Gln在环化形成pyro Glu的过程中伴随氨基的丢失使得所带正电荷丢失使得抗体净电荷减少，最终以主峰的形式被洗脱出来，而Gln未发生环化/环化不完全的抗体则会形成碱性异构体。Glu在环化过程中脱水缩合净电荷未发生改变。
| C末端赖氨酸切除
抗体分子重链C末端往往是以脯氨酸甘氨酸赖氨酸(-Pro-Gly-Lys)的氨基酸序列结尾。在细胞培养过程中，末端的赖氨酸(Lysine，Lys)被羧肽酶(Carboxypeptidases)切除，但是这种切除并不是完全的，Lys的不完全切除导致部分抗体蛋白出现Lys残留，这部分残留变体也被称为赖氨酸变体。由于Lys是碱性氨基酸，含有Lys残留的抗体以碱性变异体的形式被鉴别。
| N糖基化(唾液酸)
糖基化是蛋白或脂质在酶的作用下被连接上糖链的过程，是生物体内最重要的蛋白翻译后修饰之一。一般重组单克隆抗体N糖基化位点发生在Fc段CH2保守序列的Asn297。该位点由2个N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和3个甘露糖(Man)组成N-糖的核心五糖结构，在其末端增加不同的单糖(半乳糖、甘露糖、半乳糖等)使抗体呈现高度异质性。一般情况下，聚糖链呈中性，当糖链末端半乳糖残基增加带有负电荷的唾液酸后，会发生电荷的改变从而导致电荷异质性。
在哺乳动物表达系统产生的抗体中发现的唾液酸残基有2种主要类型：N-乙酰基-神经氨酸(NeuAc，NANA)和N-羟乙酰基-神经氨酸(NeuGc，NGNA)。其中，NANA是人体中正常所需正常的唾液酸化作用，而NGNA不是人体合成产生的，若抗体药物存在NGNA则可能具有潜在的免疫原性。由于唾液酸带负电荷，带唾液酸的抗体成分在阳离子交换色谱中先于主峰被洗脱出来，以酸性变异体形式被鉴别。
| 天冬酰氨的脱酰胺与天冬氨酸异构化
天冬酰胺(Asparagine，Asn)失去氨基形成琥珀酰亚胺(Succinimide，Asu)，从而形成酸性变异体，该过程是一个不可逆的反应。Asu不稳定水解形成天冬氨酸(Aspartic acid，Asp)或异构的天冬氨酸(isoAsp)，该过程是可逆反应，被v称为Asp的异构化。Asp的异构化虽然不改变抗体净电荷，但改变了电荷的分布，在阳离子交换色谱中以碱性峰的形式存在。
| 氧化
氧化甲硫氨酸(Methionine，Met)是抗体中最易被氧化的氨基酸。在较高的氧化压力条件下，Met会被氧化生成甲硫亚砜。虽然氧化过程中不存在净电荷的改变，但是氧化会引起抗体空间电荷分布的改变，有研究表明，Met的氧化导致碱性变异体的产生。此外，氧化也时常发生在甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸和色氨酸。
| 其他
研究表明，引起单克隆抗体电荷变异体的产生不仅有以上列举的5种修饰形式，其中还原糖与赖氨酸残基侧链或者N端伯胺之间反应形成糖化、IgG2中非典型二硫键的链接(IgG2B、IgG2A/B)、三硫键形成、高甘露糖、马来酸修饰、游离巯基发生半胱氨酰化等等都能引起抗体药物电荷变异体的产生。
02
抗体蛋白电荷异质体分析策略
蛋白质电荷变异体分析方法主要有平板等点聚焦(Isoelectric focusing gel electrophoresis，IEF)、毛细管等电聚焦电泳(Capillary isoelectric focusing gel electrophoresis，cIEF)和离子交换色谱(Ion exchange chromatography，IEC)。
| 关于 iCIEF
IEF 和 cIEF 均属于电泳法，它是根据被分析物的总电荷差异实现分离的。对于电泳法，酸性峰为低于pI值的物质，碱性峰为高于pI值的物质。目前IEF因为操作繁琐、分辨率低、定量不准确而逐渐被毛细管电泳cIEF替代，而cIEF又根据成像和检测的差异区分成传统cIEF(需用压力或改变检测器末端电极槽储备液的pH值的方法使溶质通过检测器)和全柱成像等电聚焦毛细管电泳(icIEF，采用全柱成像方式进行检测)。
与传统cIEF相比，iCIEF方法由于具备聚焦之后不需要迁移，影响因素少，通用性好等优点，目前被认为是一种平台化方法，在生物制药领域已被广泛用于电荷异质性的测定，且该方法已被收录于2020版中国药典通则3129单抗电荷变异体测定法中，作为药典标准方法。
| 关于 IEC
离子交换色谱 IEC 可分为阴离子交换色谱(AEX)和阳离子交换色谱(CEX)。由于大部分抗体都是弱碱性，CEX最为常用的。IEC是根据色谱峰保留时间定义酸性峰和碱性峰，当在阳离子交换色谱中，比主峰出峰早的物质叫酸性峰，比主峰出峰晚的色谱峰叫碱性峰。
IEC 具备方法耐用、分辨率高且不需要特殊专用仪器(高效液相即可)等优点，还可以放大用于分离制备电荷变异体做更深入的研究。但是相较于iCIEF而言，IEC法对于不同的抗体需要单独开发新的色谱方法，且对于复杂的生物制品(如融合蛋白、双抗、ADC等)使用IEC法的分辨率往往达不到理想的效果。
| iCIEF 和 IEC 差异
尽管毛细管电泳 iCIEF 和离子交换色谱 IEC 分析的蛋白质酸性物质和碱性物质分布和数量基本一致，但是由于两种分析方法原理的不同，可能会存在微小的差异。毛细管电泳iCIEF主要是基于总电荷(pI)差异进行分离，然而蛋白质本身电荷分布的差异在离子交换色谱IEC分析中也会引起关键作用，因为电荷的分布可能影响抗体与色谱填料柱树脂的相互作用。
cIEF和IEC之间的差异已在文献中反复证明和报道，例如：用弱阳离子交换(WCX)柱分离不同保留时间的小鼠单抗组分，随后毛细管电泳分析时显示相同的pI。在IEF分析中，两条重链上都有天冬氨酸(Asp)或一条重链上有一个Asp而另一条重链上有一个异天冬氨酸(isoAsp)的重组单抗具有相同的pI，但这些变体可以通过CEX解析。重组鼠/人嵌合抗体的Fab片段在轻链或重链上都含有焦谷氨酸(pyroGlu)，因此没有预期的pI差异，可以通过强阳离子交换(SCX)柱进行解析。
这些例子表明，基于色谱的分离并不完全依赖于总电荷。因此，对于抗体药物电荷变异体的研究可以结合毛细管电泳法iCIEF与离子交换色谱法IEC对蛋白进行分析，同时可结合质谱技术对于异构组分进行鉴别，是控制和稳定重组蛋白药物生产质量的有效检测手段。
03
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