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基因与细胞治疗领域的病毒载体生产用细胞株的开发

时间：2022-08-01      阅读：738

基因治疗被认为是许多严重的和危及生命的疾病有效的治疗手段，得到越来越多人的关注。同时，基因治疗的适应症正从罕见/极罕见疾病向更常见疾病发生转变，患者数量和综合疗法越来越多。因而，大规模的基因治疗病毒载体生产是行业的迫切需求。

2020年，FDA更新了关于基因治疗临床试验申请(INDs)的化学、制造和控制指导原则，内容包含稳转细胞株开发及细胞克隆性确证等。文件指出，细胞库（Cell bank）的稳定性及纯度是一个需要考虑的重要方面。非单克隆来源的细胞群中，其细胞异质性相对较高，产量低的细胞系往往与高产细胞群体竞争，导致高产细胞个体占比越来越少，最终随着传代次数的增加，导致细胞库或工作库的质量下降，因此，通过单克隆细胞筛选是提高病毒载体产量及质量的重要步骤。单克隆源性的确证是一种控制细胞种群降低其异质性的方法，通过防止异种细胞群体的产生，来保障未来生产出的病毒产品的质量不受影响。

CEVEC公司（CEVEC Pharmaceuticals）针对 ELEVECTA® AAV包装细胞系的研究数据显示，通过单克隆筛选出的细胞株其AAV产量要比非单克隆细胞来源的高10倍左右。

张瑰宜博士在“生物药生产用细胞株构建和筛选策略”研讨会上分享了她们使用Cytena 的单细胞打印机SCP的感受，其以喷墨式打印技术温和而高效的分选单细胞，简化筛选工作流程，很大的提高了单克隆有效率，获得了稳定性高及一致性好的单克隆，用于后续的AAV生产，大大的提高了AAV产量。

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克隆HEK293细胞的记录

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HEK293单克隆细胞提高AAV产量


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生物药生产用细胞株构建和筛选策略

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英国的葛兰素史克（GlaxoSmithKline，GSK）药物研究中心报告了一种如何快速获得稳转的293T细胞，生成慢病毒载体的方法：将编码所有慢病毒载体成分的单个 DNA 结构体稳转入293T细胞，单细胞打印机进行单克隆筛选，获取遗传学和功能稳定的适应悬浮培养的生产用293细胞系。由此产生的悬浮细胞系可生产出与瞬时转染一样高滴度的病毒，可以在一次性搅拌罐生物反应器中轻松放大，并且在后续细胞培养中遗传和功能稳定。此方法将降低慢病毒载体的大规模生产成本，提升慢病毒载体在细胞治疗中的应用价值。（Chen Y H , Pallant C , Sampson C J , et al. Rapid lentiviral vector producer cell line generation using a single DNA construct[J]. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2020.）

在基因编辑领域，Stephan Riesenberg等学者进行细胞克隆基因型和靶基因拷贝数分析时使用 Cas9 核糖核蛋白和 DNA 供体电穿孔在 FRMD7 基因中编辑 409-B2 hiPSC，分别用（不用）2 M M3814 处理细胞 3 天后使用单细胞打印机(Cytena)对细胞进行单克隆化用于后续分析。文章中HEK293 和 K562 细胞的单克隆化也是通过使用单细胞打印机分选单细胞来获得的。（Stephan R ,  Manjusha C ,  Dominik M , et al. Simultaneous precise editing of multiple genes in human cells[J]. Nuclc Acids Research, 2019(19):19.）

Gross等采用f.sight™单细胞打印机，通过GFP报告基因，用于选择和克隆CRISPR/Cas9编辑以敲除RANKL蛋白的间充质干细胞(MSC)，以进一步增强MSCs在再生医学中的治疗能力。
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