纯化工艺放大的风险及控制策略
时间：2024-06-14 阅读：152
在上市之前，生物制品的工艺开发可以分为三个阶段，分别为临床前阶段、一二期临床阶段、三期临床及商业化生产阶段。通常三个阶段的规模并不相同，因此在两次工艺转移时往往伴随着工艺的放大。
图1 生物制品工艺开发阶段
作为下游纯化的主要工艺，切向流过滤及层析已有成熟的放大策略，可以降低放大过程中工艺本身的风险。除此之外，物料及设备同样会对工艺放大过程产生影响，在引入时即要秉持以终为始的理念，面向生产需求进行选择。
物料的风险控制
►►►选择生产级别的物料
• 物料的级别要符合生产的级别，人用药物生产尽量选择GMP级别物料
• 物料的供应需要满足生产的要求。供应商应有足够产能，并可保证生产的持续性，满足最终生产规模的需要。
• 物料的供应链货期可以满足工艺开发的时间线，防止因物料延误产品上市。
►►►避免物料的污染
• 尽量采用非动物来源的物料，应检查产品的TSE和BSE证明。
• 相应等级物料应具备无菌、内毒素限度、菌落限度证明。
►►►选择与产品/中间品等相容的物料
• 需检查与产品/中间品接触物料的溶析出、化学耐受性以及无相关酶类证明。
►►►选择可放大的物料
• 工艺开发中所选择的滤器、膜包、中空纤维等耗材，应有适合生产规模的型号。层析填料应有足够的机械性能，可以支持大规模装柱。
工艺的风险控制
工艺选择
在一些样品珍贵的产品(如mRNA)工艺开发过程中，临床前研究时为节省样品，实验室规模通常较小，工艺中会采用试剂盒等方式。因此在首次放大时，需要选择适合的替代工艺，通常生产规模会有多种可选的技术，最佳工艺选择一般由最终生产规模决定。
工艺放大策略
线性放大是目前纯化工艺包括死端过滤、切向流过滤和层析放大采用最多的策略。
切向流线性放大中需要保持流路长度和流路内流体动力学情况的一致。前者要求实验室规模工艺开发时，即选用流路长度与放大规模使用的膜包或中空纤维型号一致的小型滤器。处理粘度较高的样品时流体动力学情况会发生变化，导致放大后超滤行为的不可预测，因此工艺中采用的浓缩因子尽量避免超过50，渗滤体积尽量低于14倍。
层析线性放大时保持柱床高度不变，扩展层析柱的直径。当柱直径超过30cm后会导致柱壁对填料的支撑降低，高流速运行下柱床更容易塌陷。除选用有放大案例的填料外，小试规模确定流速等工艺参数时，应参考填料的压力流速曲线性质。
需要注意压力流速曲线通常使用水或简单缓冲溶液测定，如果层析步骤的某阶段液体粘度较大(如结合洗脱模式蛋白洗脱阶段、CIP碱清洗阶段、以及复杂样品上样阶段等)，应进一步降速运行。
图2 百林科Chromstar® 6FF及
MaXtar® ARPA压力流速曲线
线性放大的缺点之一，是层析柱的直径并非连续，在某些案例中保持柱床高度会导致柱体积明显超过实际需要的填料数量，从而造成浪费。在亲和、不依赖柱效的离子交换和疏水层析中，可以采用恒定保留时间的放大策略，该策略下柱床高度会发生变化，柱床高度高于小规模时尤其需要注意层析柱超压和柱床塌陷的情况。
层析柱装填
层析柱装填方法应当稳健可靠，确保柱效测定结果满足工艺需求。通常用不对称因子衡量填料压缩是否合理，对称因子可接受范围应在0.8~1.8内，并满足分离的要求。装柱过紧可能会使柱床破裂，产生沟流并导致样本过早流穿。过松的柱床可能在使用中被再次压缩，产生液体间隔并在其中发生混合，降低分离效果。对依赖塔板数进行分离的层析过程，如分子筛、切峰收集的离子交换等，理论塔板数也应满足工艺要求。
其他
需要确认样品在室温的稳定性；使用pH值不受温度影响的缓冲液；确认更大规模时层析填料保存方式等
设 备
工艺放大后所使用的设备与小规模使用的设备即使采用同一原理和设计，往往也存在一些差异。
供应商应保证设备满足卫生设计的要求，保证设备不锈钢部件的抛光、焊接质量、接触物料部位的表面处理等，防止规模放大后可能的清洁死角和锈蚀污染。需要在放大后规模上检查清洁方法的适用性。
图3 百林科金属加工工艺
在此基础上，设备的一些细节也会对工艺产生的影响。比如：放大后层析系统紫外检测流通池的光径是否有变化；出口管路不同的长度和直径可能会导致系统中更显著的稀释和扩散；系统控制阀门响应速度导致的时间延迟，叠加更大的系统死体积可能导致峰收集起点和终点的错误；层析柱分配器的液流分布可能影响分离效果等放大规模的层析系统选型，主要的考虑是满足工艺步骤中的流速需求，一般来说工艺流速会在设备最大流速的中值附近。这与选择实验室层析系统的考量不尽相同，实验室层析设备为覆盖不同工艺情况，流速范围往往较宽。
图4 百林科实验室层析系统及层析空柱
实验室装柱可以采用轴向压缩法或高流速法，高流速法装柱所需要的线流速，放大后往往超出工艺运行最适配层析系统的上限。由于层析柱耐压随直径降低，高流速恒压法装柱放大也存在硬件的限制。为装柱选择更大规模的层析系统或高压层析柱并不经济，通常会采用轴向压缩法装柱。对于直径小于300mm的层析柱，手动柱即可满足装柱要求；而直径450mm以上装柱，则需要具备电动轴向压缩功能的层析柱。
图5 百林科Chrom-LinX® 手动压缩层析柱和
Verdot Ips2 InPlace工业层析柱
硬件的影响往往不会立刻显现，选择可靠、响应迅速的供应商及时处理问题，可以降低生产可能面临的风险。
纯化工艺放大是一个综合多因素的过程，尽管有着许多成功的案例，在面对一个新工艺的放大时仍然需要保持谨慎。尤其在实际的工艺中，由于资源和时间的限制，并不能以理想的方式完成工艺开发和放大的过程。以上列举了一些纯化工艺放大中常见的问题，推荐在执行工艺放大时，使用差距分析(GAP analysis)和失效模式与效应分析(Failure Modes and Effects Analysis，FMEA)等工具，针对具体的工艺情况分析规模间差距、评估过程风险并采取相应的风险控制措施，提高工艺放大的成功率。
总 结
纯化工艺放大是一个综合多因素的过程，尽管有着许多成功的案例，在面对一个新工艺的放大时仍然需要保持谨慎。尤其在实际的工艺中，由于资源和时间的限制，并不能以理想的方式完成工艺开发和放大的过程。以上列举了一些纯化工艺放大中常见的问题，推荐在执行工艺放大时，使用差距分析(GAP analysis)和失效模式与效应分析(Failure Modes and Effects Analysis，FMEA)等工具，针对具体的工艺情况分析规模间差距、评估过程风险并采取相应的风险控制措施，提高工艺放大的成功率。
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