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工艺开发与优化：上游细胞培养的实践与策略

时间：2024-01-11 阅读：2240

　　上游细胞培养是生物制药生产中的关键步骤，对最终产品的质量和产量有着直接影响，是生产高质量生物药物的关键步骤之一。旨在提高生产效率、降低成本并确保生物药物质量的一致性，随着生物技术的发展和市场对高效、可持续生产的需求增加，工艺开发与优化变得尤为重要。

　　细胞培养是生物医药领域中一项重要的技术，涉及细胞培养基的选择、细胞适应、细胞增殖、细胞分化、细胞衰老和细胞死亡等过程。以下是一些关于工艺开发及优化-细胞培养的建议：

　　 工艺开发的实践

　　 1.1 　选择合适的细胞系

　　细胞株的选择是上游细胞培养工艺开发的首要步骤。通过筛选和优化细胞株，可以提高生产效率、降低生产成本并确保产品的一致性。选择具有高表达能力和稳定遗传特性的细胞株是关键的决策。

　　 1.2 　培养基优化

　　培养基的成分和配方对细胞生长和产物表达有着直接的影响。通过系统的培养基优化，可以调节营养物质浓度、添加生长因子和调控pH值，从而提高培养效率和产物质量。

　　 1.3 　发酵过程优化

　　发酵过程是上游细胞培养的核心环节，其操作条件直接关系到细胞生长和产物表达。工艺条件包括温度、湿度、氧气浓度、二氧化碳浓度等。这些条件对细胞生长和产物表达有重要影响，可以通过实验确定最佳的工艺条件，以保证细胞的正常生长和产物的稳定表达；实时监测关键参数：通过观察细胞形态、测定细胞数量、检测细胞分泌的生物活性物质等方法，监控细胞的生长和分化情况，采取及时的反馈控制，可以保持培养过程的稳定性。

　　 1.4 　探索新的培养方法

　　不断探索新的培养方法和技术，如微载体培养、三维培养、低温培养等，以提高细胞的生长效率、分化能力和实验结果的可靠性。

　　 1.5 　质量检测和控制

　　在生产过程中进行严格的质量检测和控制，包括细胞状态检测、产物表达量检测、培养基成分检测等，以确保产品的质量和稳定性。

　　总之，上游细胞培养工艺开发需要从多个方面进行优化和改进，包括细胞系选择、培养条件、培养基成分、传代和扩增方法、监控方法、质量控制体系以及新的培养方法和技术等。通过不断优化和改进，可以提高细胞的生长效率、分化能力和实验结果的可靠性。

　　 细胞培养的优化：发酵过程的深度探讨

　　细胞培养的优化对于生物制药工业而言至关重要，而发酵过程作为上游细胞培养的核心，其操作条件对细胞生长和产物表达有着直接且关键的影响。以下是针对发酵过程优化的几个关键方面的详细展开：

　　2.1 温度的精准控制

　　在细胞培养中，温度是细胞生长和代谢的重要因素之一。在实际应用中，采用先进的发酵罐控制系统，首先选择高精度的温度传感器，再通过PID(比例-积分-微分)控制算法调整加热和冷却设备，以维持目标温度。例如，对CHO细胞的培养，可以在不同生长阶段调整最适温度，例如在细胞扩增阶段提高至37摄氏度，而在表达阶段降至33摄氏度。这样的温度调控能够更好地满足细胞在不同生长阶段的需求，提高生产效率。

　　2.2 气体流速和混合度的优化

　　控制系统实时监测数据，建立反馈控制系统，使搅拌速度和气体进气速率能够根据需要进行即时调整；以及安装高精度的电极，实时监测罐内氧气和二氧化碳浓度，以指导混合度和气液传质的调整。例如，增加搅拌速度可改善混合度，而调整气体进气速率则影响气液传质效率。在真实生产中，通过这样的模拟和实验相结合，能够更好地指导操作参数的选择，以达到最佳的气液传质效果。

　　2.3 溶氧控制与传质的平衡

　　通过在线溶氧传感器实时监测溶氧水平，并结合反馈控制系统调整搅拌速度和气体流速。例如，在细胞密度较高的情况下，可以增加气体流速，提高溶氧水平。这样的溶氧控制不仅有助于防止细胞窒息，还能够促进细胞的正常代谢，提高产物表达。

　　2.4 pH值的精准调控

　　在工艺实践中，采用酸碱控制系统，结合定期自动添加酸碱溶液的方式，以确保发酵罐内pH值稳定在目标范围。例如，CHO细胞培养中，通过添加缓冲溶液，可以防止pH值的剧烈波动。通过定期的pH监测和调整，维持发酵环境的稳定，有助于确保细胞在适宜的酸碱条件下生长，保证产物的质量。

　　2.5 传感技术在优化中的应用

　　在实际生产中，使用高精度的在线传感器，例如光学溶氧传感器和pH传感器，以实时监测关键参数，并进行数据记录，以便后续分析和优化。通过这些传感器，可以及时发现并纠正异常情况，确保操作条件的稳定性。例如，在一个具体的案例中，通过引入高精度的溶氧传感器，成功减少了培养基中氧气浓度的不均匀性，进而提高了细胞的生长速率和产物表达水平。

　　2.6 智能化和数据分析的整合

　　建立实时和历史数据分析，用于预测工艺中的变化趋势，并提供实时建议或监测任何潜在问题。结合智能模型和实时数据进行对比分析结果，持续优化过程中的控制策略，确保高效、稳定和一致性。

　　通过对这些关键方面的详细展开，可以更全面地理解发酵过程的优化策略，为实际生产中的细胞培养工艺提供指导和启示。这种深度的探讨不仅有助于解决当前生产中的挑战，也为未来细胞培养工艺的进一步创新提供了方向。

　　 如何放大以及工艺策略

　　工艺放大的目标以及策略是在规模逐渐扩大的情况下，保证细胞在稳定的环境中生长并且进行产物的表达。考量包括细胞密度、生长速率、活率、产物表达量和糖基化水平等等因素。在工艺的放大过程中关键控制参数会分为两种类型：一种是过程参数，例如温度、DO和pH、营养成分、代谢产物、渗透压等。另一种是受体积和几何尺寸影响，例如P/V、剪切力、KLa等。通常考量以下几点因素：

细胞培养工艺优化的整体考量

　　 一次性反应器工艺转移 – Agitator Speed

　　3.1 搅拌轴功率P计算

　　搅拌轴功率 P 与反应器直径D ，搅拌轴直径d，液柱高度H 。搅拌桨速度n，液体粘度μ,流体密度ρ,重量加速度g以及搅拌器的形式和反应器的结构等有关。

　　对于牛顿型流体，通过因次分析和实验研究可以得到如下关联式：

　　其中Np为搅拌轴公里特征常数；

　　ReM 搅拌雷诺系数，Fr为搅拌弗鲁特数，K和搅拌器的型式和反应器的几何尺寸有关的常数。

　　3.2 恒定功率输出

　　P/V和搅拌功率(Np，Power Number)、罐体直径、搅拌桨直径、工作体积、液体密度等很多因素有关，一定程度上体现了混合程度，影响培养体系的混合和传质。因此恒定P/V被推荐为很多工艺放大的准则，是当前最常采用的放大策略。考虑到细胞剪切力的耐受性不同，常见的P/V范围在10-40 W/m3。

　　3.3 搅拌恒定等体积功率放大

　　以单位体积培养液所消耗的搅拌功率相等为基准进行放大，在几何尺寸相似的情况下：

　　根据小罐的参数可计算的大罐搅拌转速，该转速还需结合其他参数，如线速度和KLa ，以及实验经验综合衡量后作出一定调整。

　　3.4 恒定叶端速度(Tip Speed)

　　培养工艺中，搅拌桨剪切力是需要考虑的重要因素之一。建议哺乳动物细胞的最大耐受流体速度，在玻璃罐和不锈钢搅拌生物反应器中培养哺乳动物细胞的典型范围为1-2m/s，通常，当增加到更大的生物反应器规模时，基于恒定叶端速度的放大会减少特定功率输入。

　　对于搅拌桨叶端的剪切力，一般可通过Tip Speed (m/s)=π xd xn 来表示，以及积分剪切因子；

　　恒定混匀时间是比较简单的一个放大准则，也可以作为放大的依据。但在小规模培养中(3L以下)体积可以很快达到混匀时间，而更大的体积则需要更高的叶端速度才能达到混匀。这就会导致剪切力的提高，造成细胞的损伤。

　　3.5 恒定KLa

　　KLa是氧气从气相进入到液相的速率。反应器中工艺放大的关键，O2作为细胞的重要营养物质，影响细胞的生长及代谢。恒定的KLa放大准则给细胞提供了相同的氧传递环境。但KLa的测定受很多因素影响。比如培养过程中搅拌速度、通气量等等，在实际操作过程中，KLa随着工作体积的增加而增加。当达到一定体积后，KLa CO2又会和KLa相互影响，提高了KLa恒定放大难度，我们需要很多测试方法和分析来确定合适的KLa。

　　氧传递系数KLa的测定：

　　• 测定培养基：0.1% (w/w) F68 + 6 g/L NaCl in DI water at 37℃

　　• 过程参数：Agitator 搅拌转速、Sparge空气分布管孔径、Vw装液量、Gas Flow

　　• 测定过程：

　　1. 空气平衡培养基，DO电极100%标定；

　　2. 设定测定Agitation和Sparge rate；

　　3. 通入氮气降低DO至小于5 %；

　　4. 通入空气直至DO升高至高于95 %；

　　5. 重复上述步骤测定其他条件下的KLa值；

　　6. 计算KLa值，dDO/dt= KLa (DOt-Dot-1 )Sparge

　　除此以外，还有很多的因素会影响，一定的放大规模后还需要考虑pCO2对细胞生长和蛋白表达的负面影响。小体积培养时主要是由于通入的气体在上升过程中可以带走大部分细胞代谢产生的CO2，基本不用考虑CO2去除。反而大体积培养中，CO2会随着反应器规模的扩大而降低去除能力。液体的气体饱和度和气泡量直接影响CO2去除，可以提高通气量并减少气泡停留时间可以加快移除。

　　 培养应用案例

　　本次实验使用CHO-K1 细胞，细胞根据标准方法从冻存管中复苏，然后每三到四天在摇瓶中进行传代扩增。待细胞量足够后，将细胞接入CytoLinX WB®及CytoLinX® BR-200生物反应器继续培养：