诊断试剂客户,如何利用His/GST标签纯化蛋白
时间：2023-12-15 阅读：2231
体外诊断试剂的关键原料分为两块，一是抗原抗体，二是特殊成分。抗原抗体作为重要原料，影响整个试剂的核心质量。在生产上，所用抗体一般通过重组抗原免疫动物来制备单克隆抗体或多克隆抗体，后进行配对筛选应用于免疫检测。His(组氨酸)标签和GST(谷胱甘肽S转移酶)标签常用于重组抗原的表达纯化的亲和标签。
一 His标签
His标签由于其分子量小、与金属离子结合能力强以及在变性条件下也可保持与介质结合的特性，已成为常用的亲和标签，Ni2+固定化金属离子亲和层析已成为纯化组氨酸标签蛋白的标准方法。
对于His标签的重组抗原纯化：
原理
1、His-Tag组氨酸的残基上带有1个咪唑基团，可与多种金属离子发生特殊的相互作用，如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，Fe3+等，再用咪唑竞争洗脱，达到分离纯化的效果。
2、Ni2+有六个螯合价位，被含有3,4或5个电子供体基团的螯合物固定在吸附剂上；所以IDA与His标签蛋白结合的能力相对更强，特异性较弱，而TED则相反。
百林科Ni填料产品：
高流速：Ni Chromstar® FF(NTA)
Ni Chromstar® FF是纯化组氨酸标签蛋白质的首选，具有载量高、易再生、成本低等优点。
高分辨率：Ni Chromstar® HP (NTA)
相比于 Ni Chromstar® FF，Ni Chromstar HP 具有更细的颗粒粒径，提供更高的分辨率，可有效提升纯化的蛋白纯度和浓度。
高纯度：Ni Chromstar® Excel
Ni Chromstar® Excel是百林科最新一代His标签亲和填料，采用TED五价偶联方式，Ni2+结合更牢固，不易脱落，一步纯化纯度可达到90%，具有明显优势，当然载量也会相应降低。
Ni Chromstar® FF纯化案例分享
实验步骤：
Ni Chromstar® Excel与Ni Chromstar® FF纯化对比：
由上图可以看出，纯化相同样品，Ni Chromstar® Excel纯度明显高于Ni Chromstar® FF。
Ni Chromstar® Excel优势：
01 耐受100mM EDTA，简化样品前处理，无需换液操作。
02 可直接CIP，无需脱Ni，直接进行0.1M或0.5M NaOH彻底清洗，有效避免交叉污染， 延长使用寿命。
03 Ni脱落率显著降低，无需反复再生，使用保存更加方便。
二 GST标签
GST标签(分子量~26kDa)也是重组蛋白常用的标签，其具有良好的水溶性，常被用来表达水溶性不是特别好的蛋白，增加蛋白的可溶表达。通常使用Glutathione对GST标签进行纯化，可以获得比使用His标签纯化更好的纯度，该标签的用途也非常广泛。
原 理
利用层析填料上的还原型谷胱甘肽(GSH)可以与带GST标签的重组蛋白特异性结合的性质，将重组蛋白分离出来。
百林科GST亲和纯化层析填料产品：
1 高流速：Glutathione Chromstar® FF
Glutathione Chromstar® FF高流速特点适合后期工艺放大，由于GST标签纯化原理是酶与底物的反应，所以在使用过程中也要注意流速和结合效率的平衡。
2 高载量：Glutathione Chromstar® 4B
Glutathione Chromstar® 4B具有载量高的特点，此款填料可以有效提升弱结合蛋白与柱子的结合效率，可适用于弱结合蛋白。
3 高分辨率：Glutathione Chromstar® HP
Glutathione Chromstar® HP的平均粒径约为34μm，分辨率高，所以洗脱的蛋白浓度和纯度更高，同时需要注意细粒径也会伴随着背压相对较高的特点。
GST标签亲和纯化案例[1-2]：
SDS-PAGE图片来源：
[1] 麻粉莲,张骞,郑丽舒.人乳头瘤病毒18型L1蛋白的包涵体和可溶性表达及纯化[J].生物技术通讯,2014,25(06):800-803.
[2] 石松,薛殿婷,张培等.人MAPK3基因原核表达载体的构建及鉴定[J].贵州医科大学学报,2021,46(10):1145-1150.DOI:10.19367/j.cnki.2096-8388.2021.10.005
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