慢病毒下游工艺优化策略
时间：2023-12-01 阅读：1530
慢病毒载体(Lentivirus vector, LV)是逆转录病毒科的一种包膜病毒，能够稳定整合在分裂和非分裂细胞中表达的转基因，且包装容量大、细胞毒性和免疫原性低、感染谱广、可实现稳定表达等优势，是当前基因治疗和细胞疗法广泛使用的病毒载体之一。
慢病毒载体是一种有包膜的RNA病毒，直径为80-120nm，呈二十面体对称结构、球形，包装容量一般为4.5~5kb；慢病毒的活性容易受生产工艺中的压力，剪切力，温度，盐浓度，pH等影响。
下面从几个核心步骤来介绍下慢病毒下游工艺开发策略：
慢病毒载体下游分离纯化工艺基本上采用层析分离技术和中空纤维膜两大技术。一般病毒载体纯化层析会用到分子筛，复合模式和离子交换层析等多种层析方式；中空纤维技术包括澄清过滤，切向流过滤两方面。
慢病毒纯化基本流程及核心工艺步骤优化点如下：
01 澄清收获
澄清过滤主要是去除介质中的细胞和细胞碎片及部分的HCD，HCP，并降低粘度。常用的方法为深层过滤，离心，死端过滤，或者其中两种方法结合为主，但对于50L以上规模的慢病毒载体的澄清倾向于深层过滤或0.2~0.5μm中空纤维。
02 超滤浓缩1
对澄清过滤溶液使用300~750KDa的中空纤维柱对慢病毒载体溶液浓缩换液，可以去除一部分的蛋白，DNA片段等杂质分子。浓缩过程中一般控制剪切力为2000~4000/s-1,TMP为3~7psi，通量>50LMH，浓缩5-10倍
03 核酸酶孵育
加入Benzonase核酸酶，降低DNA分子大小及粘度。核酸酶孵育一般温度在在25～37℃，处理时间30～60 min；或温度控制在2~8℃，过夜处理，核酸酶浓度在20-50 U/mL，Mg2+离子浓度在1‑10 mM
04 层析纯化
层析纯化在慢病毒载体中占有重要地位，一般选择MaXtar Q和两步层析结合的方式，去除HCP，DNA片段及质粒残留等杂质；MaXtar COLL 700(分子筛或多模式层析)层析对小于700KD的HCP，HCD及其他杂质成分进入层析介质基球的内孔，通过离子相互作用疏水左右被保留，而大于700KD的慢病毒不进入内孔流穿，从而实现分离；MaXtar Q以离子相互，与慢病毒载体结合，保留在MaXtar Q层析柱上，通过盐梯度，去除工艺杂质，收获高活性的慢病毒载体。
由于慢病毒载体受压力，剪切力，温度，盐浓度，pH等因素的影响易聚集，易失活，纯化工艺中的一般工艺参数，在15~25℃温度下层析条件优化：MaXtar COLL 700/400 载量: 3~15CV，流速：150~300cm/h；MaXtar Q 载量：5~50CV，洗脱盐浓度：0.5~0.8M NaCl，洗脱液要及时稀释降低盐浓度。
百林科的MaXtar COLL 700在慢病毒纯化使用中的案例分享：
Case1：COLL 700 在慢病毒上的应用案例
Case2：COLL 700在慢病毒上的应用
结论：回收率和杂质去除效果均达到去除的预期。
05 超滤浓缩 2
对澄清过滤溶液使用300~750KDa的中空纤维柱对慢病毒载体溶液浓缩换液。浓缩过程中一般控制剪切力为2000~4000/s-1,TMP为3~7psi，浓缩慢病毒载体至合适的滴度和换液至制剂需要的缓冲液。
对于不同慢病毒载体可以选择以下百林科的产品进行纯化分离：
以上几款百林科层析介质产品特点可汇总如下表：
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