纯化小技巧| 离子交换层析去除内毒素
时间：2023-09-28 阅读：3733
研发和生产中，提到内毒素，脑袋里冒出的第一个想法是不是 “难缠的对手”？那么，如何给予“对手”强有效的致命一击呢？别急，咱们接着聊。
内毒素(Endotoxin)是复杂的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，构成所有革兰氏阴性菌外细胞壁的固有部分，并负责细胞壁的组织和稳定性。它们由三个不同的区域组成：菌体特异性多糖、非特异性核心多糖和脂质A。其中，脂质A是其主要的毒性成分。
在细菌细胞死亡溶解或用人工手段破坏了细菌细胞结构后，内毒素会被释放出来，对宿主造成毒性作用。对于内毒素引起的毒性反应，主要有发热反应、多器官功能衰竭、感染性休克、败血症、脑膜炎球菌血症等。
内毒素单体分子量约10KD左右，在不同成分的水溶液中，可形成大分子聚合体，最大可以超过1000 KD。内毒素对热有很强耐受性，只有160℃以上的高温持续2~4 h，或者采用强酸、强碱、强氧化剂加热煮沸30 min以上才能破坏其生物活性。
由于内毒素的危害性，中国药典和美国药典对于内毒素的检查和要求都做了明确规定：在研发和生产过程中，除了确保无菌操作及所有与料液有接触的设备、耗材、试剂等均无引入外源性内毒素污染风险的同时，采取必要且有效的工艺手段或工艺方法，降低或去除内源性内毒素污染，达到工艺要求，提高产品安全性。
去除内毒素有多种工艺方法，层析技术目前也是从成本和有效性上比较突出的方法之一。利用内毒素分子的不同性质，可以采用不同原理的层析方法，其中，本文重点展示了层析方法中的离子交换层析法。
内毒素含有脂质A，而脂质A中含有多个磷酸根结构，等电点比较低，通常是3.1。当溶液pH值高于其等电点时，内毒素带有部分的负电荷，可以结合带正电的阴离子交换层析介质。因此，可以利用强阴离子交换层析介质结合内毒素，目标蛋白流穿的方式去除内毒素。
其中，百林科可以提供不同的强阴离子交换层析介质的选择，如MaXtar Q、MaXtar Q HR、MaXtar Q HR XL、Q Chromstar BB、Q Chromstar FF、Q Chromstar HP、Q Chromstar XL、Q Chromstar BB XL等，根据不同的工艺要求，可以选择不同的层析介质。
MaXtar Q HR参数介绍
* 动态载量的测量条件：
装柱高度：10 cm，测试流速150 cm/h ，测试缓冲液：0.05 M 乙酸钠溶液，pH4.75，测试样品：6 mg/ml 的BSA 样品，当BSA 的穿透量达到10% 时，单位介质体积(ml) 的BSA 上样量(mg)。
** 工作范围:
在该pH值范围内，介质的功能不发生明显变化。
*** v/v：体积比
应用案例：
质粒纯化中使用MaXtar Q HR去除内毒素
✦ 层析柱：Chrom-Screen MaXtar Q HR 4.7ml；10 cm
✦ 上样：亲和纯化后质粒样品(保留时间：5 min)
✦ 平衡液：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
✦ 洗脱液：1.0M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
MaXtar Q HR层析图谱
小结：经MaXtar Q HR填料纯化后，内毒素含量<5EU/mg，符合内毒素控制的质量要求。
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参考文献
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