质粒的整体解决方案-下游篇
时间：2023-08-18 阅读：3289
目前百林科除了可以提供上游质粒发酵的一次性解决方案，从大肠收获，裂解，纯化等工艺步骤提供系统的解决方案，具体如下图：
图1 百林科在质粒上的整体解决方案
上游通过大肠杆菌表达菌体，通过菌体收获，下游的裂解工艺，澄清过滤、浓缩工艺，层析纯化工艺可以获得高纯度的超螺旋DNA(scDNA)。下面从裂解以及澄清和层析等方面做重点的解析：
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裂解工艺策略：大肠杆菌的裂解通常会采用碱裂解的方法进行，操作方法简单，经济。在大肠杆菌的菌体裂解时释放大量的RNA、线性DNA，开环质粒(ocDNA)及宿主蛋白(HCP)、宿主核酸(HCD)、内毒素等杂质，这些杂质给后续的超螺旋质粒的纯化带来极大的挑战。碱裂解工艺可通过优化菌体的悬浮比例，裂解比例，裂解时长，中和比例和时间等参数，减少杂质的产生，提高裂解效率。百林科可以提供相应的Mixer 作为裂解设备来满足GMP生产阶段的需求。
图2：百林科用于质粒裂解的设备
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澄清过滤：根据工艺需要一般选用10~50μm的除絮状沉淀和0.45μm孔径的滤器进行二级澄清过滤或0.2μm的中空纤维膜进行澄清过滤，收集的澄清液进行TFF浓缩换液。澄清过滤可通过优化滤器材质，滤器的膜过滤载量，膜通量；0.2μm的中空纤维膜可选择百林科的TFFNOVA®系列的中空纤维柱，目前在大肠的裂解澄清液中能达到平均30LMH的处理通量。
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图3：百林科中空纤维以及在大肠澄清上的应用
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浓缩工艺策略：超滤浓缩可以去除RNA，HCP等其他杂质，所需上样体积。浓缩换液以优化膜包或者中空纤维的材质、孔径，浓缩倍数，TMP控制，剪切力控制，提高工艺的重复性和可放大性。
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层析纯化工艺开发策略：目前质粒层析工艺Chromstar 6FF+MaXtar PlasmidCap HR+MaXtar Q HR三步法最为经典常用，针对不同的质粒产品和用户需求，百林科也有不同的质粒产品纯化策略，例如可以使用BaronCHT Type II去除HCD和ocDNA，或者使用CaCl2或硫酸铵沉淀样品后使用MaXtar Q+MaXtar PlasmidCap HR/ BaronCHT Type II两步层析纯化超螺旋质粒。
图4：百林科纯化质粒的工艺路线
下面我们以经典的三步法
做纯化工艺的分享
做纯化工艺的分享
第一步分子筛层析：
根据目标产物与杂质的分子量差异和分子构象差异，通过优化上样体积与浓度，流速，柱高等因素，主要去除HCP，HCD及RNA等杂质。
推荐使用: 百林科 Chromstar 6FF
推荐buffer 体系： 2.1 mol/L (NH4)2SO4+50mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA，pH=7.3~7.7
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图5：Chromstar 6FF在质粒纯化的效果
质粒亲和层析
根据利用PlasmidCap配基的嗜硫吸附及亲水-疏水混合模式作用，可去除结合能力较弱的线性DNA，ocDNA，主要通过上样载量，保留时间，上样与洗脱的pH及电导的优化，提高超螺旋DNA比例。
推荐使用：百林科 MaXtar PlasmidCap HR
推荐buffer 体系：
EQ Buffer：1.9 mol/L (NH4)2SO4+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA，pH=7.3~7.7
Elution Buffer：1.7 mol/L (NH4)2SO4+0.3 M NaCl+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA，pH=7.3~7.7
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图6：MaXtar PlasmidCap HR在质粒上的应用(去除OcDNA)
阴离子交换层析
依据不同电荷的分子保留强弱的不同，达到去除内毒的目的。主要通过上样载量，保留时间，洗脱电导和pH的优化，高纯度，低工艺杂质的超螺旋质粒。
推荐使用：百林科 MaXtar Q HR
推荐Buffer 体系：
EQ Buffer：0.4 M NaCl+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA，pH=7.3~7.7
Elution Buffer：0.8 M NaCl+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA，pH=7.3~7.7
图7：MaXtar Q HR在质粒上的应用
客户使用百林科三步层析法纯化质粒的结果汇总：
如果遇到一些质粒的聚集体等的去除可以尝试CHT的纯化方案。CHT是一种无机纯相层析介质，高温焙烧成球体，可同时实现阳离子交换和钙金属亲和混合分离模式，在去除聚集体和HCD方面具体的优势。
CHT在超螺质粒纯化去除HCD及scDNA，优化上样及洗脱条件可获得更高纯度的超螺旋质粒。
图8：BaronCHT Type II在质粒纯化上的应用(7.7 mm×100 mm，4.7mL/CV)
两步层析纯化
菌体裂解液继续超滤浓缩后的样品，经过CaCl2或硫酸铵沉淀后质粒样品可以，经过离子交换层析和亲和层析结合纯化超螺质粒，推荐MaXtar Q HR + MaXtar PlasmidCap HR ，通过优化上样，洗脱等工艺条件，可获得理想的超螺旋质粒。或者MaXtar COLL 700+ MaXtar PlasmidCap HR的方案，其中COLL700是一款复合层析介质。区别于传统的层析介质，它由两层不同的结构组成：外壳是多孔的钝化层 ，确保 700KD 以上的大分子不会进孔，直接走外水流穿；核心是偶联了同时具有疏水和吸附负电荷作用基团的球形内核，更大程度结合宿主蛋白、 核酸等杂质。菌体裂解液继续超滤浓缩后的样品，经过COLL 700复合层析和亲和层析结合纯化超螺质粒，推荐MaXtar COLL 700+MaXtar PlasmidCap HR，通过优化上样，洗脱等工艺条件，可获得理想的超螺旋质粒。
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