安捷伦高效液相色谱仪_高效液相色谱仪使用步骤
一、高效液相色谱仪使用步骤常规操作
(1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
(2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
(3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
(4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
(5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。
(6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。
(7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。
(8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
(9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。
(10)．填写登记本，由负责人签字。
二、高效液相色谱仪使用步骤详细操作
1、开机设定参数（检测波长、流速），更换所需流动相，检查色谱柱是否正确。
2、排液置换管路中流动相，冲洗进样阀，洗好进样针。
3、冲洗色谱柱进行平衡，其间可提前进行样品的处理，样品信息的注册。
4、平衡好以后进空白试验，排除系统污染。
5、柱子稳定好以后进样，等待运行结束（其间清洗进样针），积分计算，出具报告。
详细操作步骤如下：
1、开机操作：
（1）、打开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，打开计算机，打开Bootp Server（一般启动时已打开）；
（2）、自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时（有六行字符），打开工作站（先打开On line）；
（3）、打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准；
（4）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液；
（5）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。
2、先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相），正式进样分析前30min左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命；
3、建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；
4、使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；
5、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；
6、实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。冲洗过程中关闭D灯、W灯；
7、关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关；
8、使用者须认真履行仪器使用登记制度，不要擅自拆卸仪器。
流动相：
1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；
2、水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；
3、使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；
A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。
样品：
1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；
2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；
手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；
色谱柱：
1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；
2、使用符合要求的流动相；
3、使用保护柱；
4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。
5、色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；
6、不要高压冲洗柱子；
7、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；
三、Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法
1仪器组成及开机
1.1仪器组成本仪器由Waters 2695分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。
2695分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。
1.2开机依次接通2695分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通2695分离单元后，约20s仪器开始自检，约1min后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“Idle”时，仪器进入待命状态。
2溶剂管理系统的准备
2.1流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status】，进入“Status（1）”屏幕，光标选“Degasser”，按【Enter】，显示选项屏幕，光标下移选“Continuous”，按【Enter】。
2.2启动溶剂管理系统
2.2.1干启动当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“Status（1）”屏幕下，按【Direct Function】，光标选“Dry Prime”，按【Enter】，显示“Dry Prime”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA】，光标选“Duration”，按数字键输入5min，按【Continue】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。
2.2.2湿启动在“Status（1）”屏幕下，光标选“Compomtion”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function】，光标选“Wet Prime”，按【Enter】，显示“Wet Prime”屏幕，输入7.5Ml/min和6min，按【OK】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。
2.2.3平衡真空脱气机在“Status（1）”屏幕下，光标选“Composition”，输入流动相的组成，按【Enter】再用光标选“Degasser”中的“Normal”，按【Enter】，按【Direct Function】，光标选“Wet Prime”，输入0.000mL/min和10min.，按【OK】。待限定时间结束后，按【Abort Prime】。
3样品管理系统的准备
3.1冲洗自动进样器在“Status（1）”屏幕下，光标选“Composition”，输入流动相的组成。按【Direct Function】，光标选“PurgeInjector”，按【Enter】，显示“Purge Injector”屏幕，输入“Sample Loop Volumes 6.0”，光标下移“Compression Check”，按任意数字键，按【OK】。
3.2冲洗进样针在主屏幕下，按【Diag】，显示“Diagnositcs”屏幕，按【Prime Ndl Wash】，显示“Prime Needle Wash”屏幕，按【Start】，30s内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit】。
3.3冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下，按【Diag】，显示“Diagnosities”屏幕，按Prime Seal Wash，显示“Prime Seal Wash”屏幕，按【Start】，待排放口有水流出，按【Halt】、【Close】、【Exit】。
3.4装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“Door is Open”屏幕，装入样品盘，按【Next】，直至所有样品盘装毕，关仓门。
4编辑分析方法及执行样品分析表
在主屏幕下，按【Develop Methods】，显示“Methods”屏幕。
4.1编辑分析方法
4.1.1建立新的分离方法在“Method”屏幕下，按【New】、【Separation Methods】，输入方法名，按【Enter】，显示分离方法屏幕，该屏幕共有6页，通过按【Next】或【Prev】切换。如需设定梯度，在第（1）页按【Gradient】，输入后按【Exit】；如需设定色谱柱的温度，在第（4）页输入后按【Exit】；在第（6）页设定检测器的种类，光标选“Absorbance Detector”，按【Enter】，光标选“48 6﹨2487”，按Abs（1）图标，设定检测波长，按【OK】、【Exit】、【Save】。
4.1.2编辑已建立的分离方法在“Methods”屏幕下，光标选欲编辑﹨修改的分离方法的图标，按【Edit】，编辑改各种分析参数，按【Exit】、【Save】。
4.2编辑执行样品分析表
4.2.1建立新的样品组在“Methods”屏幕下，按【New】、【Sample Set】，输入样品组名，按【Enter】，显示方法组屏幕，在样品组表中输入待分析样品的信息。在“Vial”中输入样品放置的位置；在“Function”中光标选择“Sandard”或“Sample”；在“Method”中选择已建立的方法；在“inj”中输入进样的次数；在“μL”中输入进样的体积；在“min”中输入运行时间。按【Exit】、【Save】。
4.2.2编辑已建立的样品组在“Methods”屏幕下，光标选欲编辑﹨修改的方法组的图标，按【Edit】，编辑﹨修改待分析样品的信息，按【Exit】、【Save】。
5运行样品
5.1在“Status（1）”屏幕下，光标选“Method”，按【Enter】，选已建立的分离方法；光标选“Flow”，输入流速，光标选“Composition”，输入流动相的组成。
5.2在主屏幕下，按【Run Samples】，光标选已建立的样品组，按【Run】、【Satrt】。
6报告打印
在主屏幕下，按【Config】，显示“Configuration”屏幕，按【Reports】，在“Report Options”对话框中选择欲输出到打印机或软盘的信息，按【OK】、【Exit】。
7关机
7.1使用完毕，按规定用适当的溶剂冲洗色谱柱、系统管路、自动进样器、进样针和柱塞杆密封垫，确保2695分离单元已冲洗干净后，关闭电源开关。
7.2数据采集完毕后，关闭检测器电源开关。
7.3处理数据并打印报告后，关闭计算机和打印机电源开关，并做使用登记。
附注：
（1）2695分离单元除用上述的系统控制模式外，还可设置非交互模式和色谱工作
站控制模式，详见仪器使用说明书。
（2）色谱管理工作站
①配置安装了数据处理软件的计算机。
②数据处理如果使用Waters的Millennium色谱管理工作站控制2695分离单元分析测定样品，当工作站采集数据时，2695分离单元屏幕上方的标题区出现“Remote”。色谱管理工作站的基本操作步骤为：设置一个含有2695分离单元的色谱系统，建立一个含有2695分离单元的仪器方法，用已获得的仪器方法建立一个方法组，用已建立的方法组运行样品，处理并打印出色谱运行所得到的数据
四、高效液相色谱仪注意事项
高效液相色谱法(HPLC)是目前应用广泛的分离、分析、纯化有机化合物(包括能通过化学反应转变为有机化合物的无机物)的有效方法之一。 在已知的有机化合物中，约有80%能用高效液相色谱法分离、分析，而且由于此法条件温和，不破坏样品，因此特别适合高沸点、难气化挥发、热稳定性差的有机化合物和生命物质。
高效液相色谱仪是在经典液相柱色谱仪的基础上，引入了气相色谱仪的理论，采用了高压、高效固定相、梯度洗脱技术和高灵敏度检测器，具有高压、高速、高效、高灵敏度、高选择性和应用范围广等特点。
高效液相色谱仪使用注意事项:
1、高效液相色谱的流动相应采用色谱纯溶剂，以满足仪器要求、避免损坏色谱柱;
2、严禁使用有污染的水等冲洗色谱柱，避免将互不相溶的溶剂一同进入泵内;
3、流动相需经过滤、除气后方可使用;
4、待分析的样品必须溶解澄清、过滤，以避免堵塞、损坏色谱柱;
5、分析完成后，须注意及时清洗色谱柱和检测器的比色池。
五、高效液相色谱柱标准操作程序(SOP)
为啥要学习使用高效液相色谱柱？
色谱柱的使用和保养：液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路，建立高效液相色谱柱日常维护与保养规程，保证能正常使用。
液相色谱柱的安装
1、液相色谱柱的结构：
（1）液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。
柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。空柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。
密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。
（2）柱填料：
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。
正相柱：
多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合-CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
反相柱：
主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。
常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3-10μm之间。
2、色谱柱的安装：
（1）拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
（2）拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。
（3）按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如，条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57 mm、内径为0、1～0.3 mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止。
液相色谱柱的使用
色谱柱在使用前，进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是更佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。
1、样品的前处理：
（1）使用流动相溶解样品；
（2）使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质；
（3）使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质；
2、流动相的配制：
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此，要求流动相具备以下的特点：
（1）流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
（2）流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
（3）流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时，降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
（4）流动相的物化性质要与使用的检测器相适应，如使用UV检测器，使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
（5）流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
（6）在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、 流速的选择：
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求更佳柱效，使用更佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1mL/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8mL/min为佳。当选用更佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如，使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
4、 流动相使用注意事项：
（1）由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。
（2）对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。
（3）含水流动相在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。加入xx，防止细菌生长。
（4）流动相要求使用0.45μm滤膜过滤，除去微粒杂质。
（5）使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
液相色谱柱的保存
1、反向色谱柱实验后的保养：
使用缓冲液或含盐的流动相，实验完后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。
2、长期保存色谱柱：
如，色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下，对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水(含防腐剂或硫柳汞)中，并将堵头堵上，储存温度应该是室温。
液相色谱柱的再生
因为，色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说是柱效的下降。
1、反向柱的再生：
依次采用20～30倍的色谱柱体积的甲醇:水=10:90(V/V)，乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。
2、正相柱的再生：
依次以20～30倍的色谱柱体积正己烷、异丙醇(异丙醇粘度大，可降低流速，避免压力过高)、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意以上溶剂必须严格脱水。
3、离子交换柱的再生：
长时间在缓冲溶液中使用和进样，将导致色谱柱离子交换能力下降。用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再生，反之，用稀碱缓冲溶液冲洗可以使阴离子柱再生。
特别说明：
再生过程必须随时关注柱压变化，柱压过高易导致硅胶变形与开裂及键合相极性端连接顺序紊乱，同时要保证再生时间足够。再生时选择不具备在线脱气的独立泵送系统色谱仪器进行，以防正相溶剂损坏脱气机密封膜或分子筛及比例阀等仪器精密部件。
液相色谱柱常见问题分析与解决方案
1、使用一段时间后柱压过高：
解决方案：首先查看是否HPLC系统原因，排除系统原因后，原因基本是由于实验过程中杂质在柱中的累积。尽量完善操作条件，做完样品后要及时冲洗干净，如缓冲盐的流动相一定要用高比例的水溶液(如，90%)冲洗后再用有机相保存。
2、筛板堵塞与柱头塌陷：
解决方法：如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，小心取下筛板，用5%左右的硝酸溶液超声处理20分钟左右，再用纯水超声20分钟左右，重新装入色谱柱。
3、色谱柱头的填料被样品污染：
解决方法：
如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。
4、色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出：
解决方法：
如确定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。
注意事项：
1、无论何时，必须保证色谱柱柱床不干涸，尤其是进样检测和柱冲洗过程中不能让流动相长时间(30min以上)走空，否则易使色谱柱干涸且带入大量几乎无法排出的气泡，甚至导致柱床局部塌陷或中部开裂。
2、使用与保存时，严禁用力甩，杜绝不小心猛烈撞击或高处掉落，否则，易导致柱床机械性损坏，则再无再生可能。
3、当柱子和液相色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；
4、避免使用高粘度的溶剂作为流动相；
5、进样样品要全溶解；
6、大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2～7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围；
7、每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；
8、每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；
9、若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。
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